Modele aut w skali 1 43

. . Des injections de blastocystes ont été effectuées pour générer des chimères mâles. Les souris germinale Rab43 +/FL ont été croisées à des souris 129s6-TG (PRNP-GFP/CRE) 1blwd pour la suppression constitutive de germinale (RAB43Δ/Δ 129). Germline Rab43 +/f ont également été croisés à B 6.129 S4-gt (ROSA) 26Sortm1 (FLP1) Dym/JRainJ (FLPeR) pour supprimer la cassette de néomycine, générant l`allèle Rab43fl. Les souris Rab43 +/FL ont été croisées de 10 générations à l`arrière-plan C57BL/6J (Stock n ° 029844). Rab43 +/FL ont été soit élevés à B6. C-TG (CMV-CRE) 1Cgn/J pour produire des souris Rab43Δ/Δ B6 (n ° de stock 029845) ou élevées en B6. CG-TG (Itgax-CRE) 1-1Reiz/J (CD11c-CRE) souris du laboratoire Jackson pour générer la suppression conditionnelle de Rab43. Les expériences de cytométrie en flux et de tri cellulaire ont été réalisées sur un instrument FACS CantoII, FACSAriaII ou FACSAria fusion (BD) et analysées à l`aide du logiciel d`analyse FlowJo (Tree Star). La coloration a été effectuée à 4 ° c en présence du bloc FC (clone 2.4 G2; BD) dans le tampon de tri cellulaire (MACS) à activation magnétique (PBS de Dulbecco [DPBS] + 0,5% BSA + 2 mm EDTA). Les anticorps suivants ont été achetés à partir de BD: anti-DC (145-2C11), anti-V (53-6.7), anti-CD11c (HL3), Anti-CD19 (1D3), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD172a (P84), anti-Ly6C (AL-21), anti-Ly6G (1A8), et anti-H-2KO (AF6-88,5).

Les anticorps suivants ont été achetés chez BioLegend: anti-CD4 (RM4-5), anti-CD11c (n418), anti-CD24 (M1/69), anti-CD115 (AFS98), anti-CD135 (A2F10), anti-MHCII (i-A/i-E; M5/114.15.2) et anti-TCR-Vα2 (B 20.1). Les anticorps suivants ont été achetés auprès d`eBioscience: anti-CD44 (IM7), anti-CD 45,2 (104), anti-CD (53-2.1), anti-CD103 (2E7), anti-CD117 (2B8), anti-CD317 (eBio927), anti-F4/80 (BM8), anti-TER119 (TER-119), anti-CD62L (MEL-14), et anti-SiglecH (eBio440c). Les anticorps suivants ont été achetés chez Tonbo Biosciences: anti-CD11b (M1/70) et anti-CD 45,1 (A20). Le défaut de l`amorçage des cellules T était spécifique à la présentation croisée parce que la présentation directe des ovules intracellulaires et de la présentation du MHCII n`était pas affectée chez les souris Rab43Δ/Δ (Fig. 4, G et H). En résumé, RAB43 fonctionne dans une voie spécifique à la présentation croisée qui est impliquée dans la présentation de l`antigène soluble à la cellule et à faible dose par les DCs CD8α +. Une grande partie du travail effectué pour identifier ces voies de présentation croisée s`est appuyée sur des DCs dérivées de monocytes (moDCs) et, par conséquent, des voies non décrites qui sont propres à CD8α + DCs in vivo (Cebrian et coll., 2011; Nair-Gupta et coll., 2014; Zehner et coll., 2015). Nous avons identifié RAB43 comme une petite GTPase qui est spécifiquement exprimée en CD8α + DCs et est nécessaire pour la présentation croisée optimale des antigènes cellulaires-associés et solubles par CD8α + classiques DCs (cDCs) mais pas moDCs.

Nous montrons que le RAB43 est localisé dans les vésicules du Golgi et du cytoplasme distincts des lysosomes et qu`il n`est pas essentiel pour le développement normal de Golgi, contrairement aux suggestions précédentes (Haas et al., 2007). . Les cellules ont été traitées à l`aide d`un kit RNeasy mini (QIAGEN) et d`une transcription inversée Superscript III (Invitrogen) suivant le protocole du fabricant pour obtenir l`ARN et l`ADNc ultérieur. Un système de PCR en temps réel StepOnePlus (systèmes appliqués Biosystems) a été utilisé selon les instructions du fabricant avec la méthode de quantification-standard Curve et HotStart-IT SYBR Green quantitative PCR Master Mix (Affymetrix). Les conditions de PCR étaient de 95 ° c pendant 10 min, suivies de 40 2-cycles d`étape de 95 ° c pendant 15 s et 60 ° c pendant 1 min. Les amorces utilisées pour la mesure de RAB43 étaient les suivantes: RAB43 PCR quantitative Forward, 5 ′-ACTGGATCGAGGATGTGAGG-3 ′; et inverser, 5 ′-ACATTGCTGGAGTCCTTTGC-3 ′.